การโคลนดีเอ็นเอ: นิยาม, กระบวนการ, ตัวอย่าง

เนื้อหา

• การโคลนดีเอ็นเอ: ภาพรวมความหมายและกระบวนการ
• วิธีพลาสมิดเวกเตอร์
• วิธี PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส)
• การใช้ Plasmid Vector และ PCR DNA Clone ด้วยกัน
• ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอเพื่อเทคโนโลยีชีวภาพ
• ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอเพื่อการวิจัย
• ตัวอย่างของการโคลนดีเอ็นเอสำหรับยีนบำบัด

ความเป็นไปได้ที่จะโคลนสิ่งมีชีวิตทั้งหมดเช่นตุ๊กตาแกะ แต่การโคลนดีเอ็นเอนั้นแตกต่างกัน มันใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยาเพื่อทำ สำเนาที่เหมือนกันของลำดับ DNA หรือยีนเดี่ยว.

การใช้วิธีการทางพันธุวิศวกรรมจะมีการระบุและแยกส่วนของรหัสพันธุกรรม DNA การโคลนดีเอ็นเอจากนั้นคัดลอกลำดับกรดนิวคลีอิกในส่วน

สำเนาที่เหมือนกันที่เป็นผลลัพธ์สามารถใช้สำหรับการวิจัยเพิ่มเติมหรือสำหรับการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีชีวภาพ บ่อยครั้งที่ยีนที่ถูกคัดลอกเข้ารหัสโปรตีนที่สามารถเป็นส่วนหนึ่งของการรักษาพยาบาล เทคโนโลยีดีเอ็นเอรวมถึง การโคลนดีเอ็นเอ กำลังสนับสนุนความเข้าใจว่ายีนทำงานอย่างไรและรหัสพันธุกรรมของมนุษย์มีอิทธิพลต่อการทำงานของร่างกายอย่างไร

การโคลนดีเอ็นเอ: ภาพรวมความหมายและกระบวนการ

การโคลนดีเอ็นเอเป็นกระบวนการทางชีววิทยาโมเลกุลในการทำสำเนาส่วนที่เหมือนกันของ DNA ที่อยู่ในโครโมโซมที่มีรหัสพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตขั้นสูง

กระบวนการสร้างปริมาณมาก ลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย. จุดประสงค์ของการโคลนดีเอ็นเอคือการสร้างลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายหรือสร้างโปรตีนที่เข้ารหัสในลำดับเป้าหมาย

วิธีการสองวิธีที่ใช้ในการโคลนดีเอ็นเอเรียกว่า พลาสมิดเวกเตอร์ และ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR). ใน พลาสมิดเวกเตอร์ วิธีการถูกตัดโดยใช้เส้นดีเอ็นเอ เอนไซม์ จำกัด เพื่อสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอและส่วนที่เป็นผลลัพธ์จะถูกแทรกในพาหะโคลนที่เรียกว่าพลาสมิดสำหรับการทำซ้ำเพิ่มเติม พลาสมิดจะถูกวางไว้ในเซลล์แบคทีเรียที่ผลิตสำเนาดีเอ็นเอหรือโปรตีนที่เข้ารหัสแล้ว

ใน วิธี PCRส่วนของเส้นดีเอ็นเอที่จะทำซ้ำถูกทำเครื่องหมายด้วยเอนไซม์ที่เรียกว่า ไพรเมอร์. เอนไซม์โพลีเมอเรสทำสำเนาส่วนที่ทำเครื่องหมายไว้ของสายดีเอ็นเอ วิธีนี้ไม่ได้ใช้เอ็นไซม์ จำกัด และสามารถสร้างดีเอ็นเอที่ลอกจากตัวอย่างขนาดเล็กได้ บางครั้งทั้งสองวิธีใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอร่วมกันเพื่อรวมคุณสมบัติที่ดีที่สุดของแต่ละปฏิกิริยาโดยรวม

วิธีพลาสมิดเวกเตอร์

เวกเตอร์ของวิธีการนี้หมายถึงพลาสมิดที่ใช้เพื่อเก็บส่วนดีเอ็นเอเป้าหมายที่จะทำการโคลน พลาสมิดเป็นเส้นวงกลมเล็ก ๆ ดีเอ็นเอที่ไม่ใช่โครโมโซม พบได้ในสิ่งมีชีวิตหลายชนิดรวมถึงแบคทีเรียและไวรัส

พลาสมิดแบคทีเรียเป็นเวกเตอร์ที่ใช้สำหรับการแทรกส่วนดีเอ็นเอเป้าหมายในเซลล์แบคทีเรียเพื่อทำซ้ำต่อไป

การเลือกและแยก DNA เป้าหมาย: ก่อนที่จะเริ่มกระบวนการโคลนนิ่ง DNA ได้จะต้องระบุลำดับดีเอ็นเอโดยเฉพาะอย่างยิ่งจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของส่วนดีเอ็นเอ

ลำดับดีเอ็นเอดังกล่าวสามารถพบได้โดยใช้ดีเอ็นเอที่มีอยู่กับลำดับที่รู้จักหรือโดยการศึกษาโปรตีนที่ผลิตโดยลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย เมื่อทราบลำดับแล้วสามารถใช้เอนไซม์ จำกัด ที่สอดคล้องกันได้

การตัด DNA เป้าหมายด้วยเอนไซม์ จำกัด : มีการเลือกเอ็นไซม์ จำกัด เพื่อค้นหารหัส DNA ที่จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับเป้าหมาย

เมื่อเอ็นไซม์ จำกัด พบว่ามีลำดับรหัสคู่ของฐานคู่ที่เรียกว่าไซต์ จำกัด พวกมันจะแนบตัวเองกับ DNA ที่ตำแหน่งนั้นและหมุนตัวเองรอบ ๆ โมเลกุลของดีเอ็นเอ ขณะนี้ส่วนดีเอ็นเอที่ถูกตัดซึ่งมีลำดับเป้าหมายพร้อมให้ทำซ้ำแล้ว

การเลือกพลาสมิดเวกเตอร์และใส่ DNA เป้าหมาย: พลาสมิดที่เหมาะสมนั้นประกอบด้วยลำดับการเข้ารหัส DNA เช่นเดียวกับเกลียวดีเอ็นเอที่ถูกตัดดีเอ็นเอเป้าหมาย เกลียวดีเอ็นเอแบบวงกลมของพลาสมิดจะถูกตัดด้วยเอนไซม์ จำกัด เช่นเดียวกับที่ใช้สำหรับการตัดดีเอ็นเอเป้าหมาย

เอนไซม์ DNA ligase ใช้เพื่อส่งเสริมการเชื่อมโยงส่วนดีเอ็นเอและจุดสิ้นสุดของส่วนเชื่อมโยงดีเอ็นเอเป้าหมายขึ้นกับปลายตัดของดีเอ็นเอพลาสมิด DNA เป้าหมายตอนนี้เป็นส่วนหนึ่งของเกลียวดีเอ็นเอพลาสมิดแบบวงกลม

การใส่พลาสมิดเข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย: เมื่อพลาสมิดมีลำดับดีเอ็นเอที่จะโคลนโคลนที่เกิดขึ้นจริงสามารถเกิดขึ้นได้โดยใช้กระบวนการที่เรียกว่า การเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรีย. พลาสมิดจะถูกแทรกเข้าไปในเซลล์แบคทีเรียเช่น E. coli และเซลล์ที่มีส่วนดีเอ็นเอใหม่จะเริ่มผลิตสำเนาและโปรตีนที่เกี่ยวข้อง

ในการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียเซลล์เจ้าบ้านและพลาสมิดจะถูกบ่มที่อุณหภูมิของร่างกายประมาณ 12 ชั่วโมง เซลล์ดูดซับพลาสมิดบางส่วนและถือเป็นพลาสมิดดีเอ็นเอของตัวเอง

การเก็บเกี่ยว DNA และโปรตีนโคลน: พลาสมิดส่วนใหญ่ที่ใช้ในการโคลนดีเอ็นเอมี ยีนต้านทานยาปฏิชีวนะ รวมอยู่ใน DNA ของพวกเขา ในขณะที่เซลล์แบคทีเรียดูดซับพลาสมิดใหม่มันก็จะดื้อต่อยาปฏิชีวนะ

เมื่อวัฒนธรรมได้รับการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะเฉพาะเซลล์ที่ได้รับพลาสมิดใหม่เท่านั้นที่รอดชีวิต ผลที่ได้คือวัฒนธรรมที่บริสุทธิ์ของเซลล์แบคทีเรียที่มีดีเอ็นเอโคลน DNA นั้นสามารถเก็บเกี่ยวได้หรือผลิตโปรตีนที่สอดคล้องกันได้

วิธี PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส)

วิธี PCR นั้นง่ายและคัดลอก DNA ที่มีอยู่แล้ว มันไม่จำเป็นต้องมีการตัดด้วยเอนไซม์ จำกัด หรือการแทรกลำดับพลาสมิดดีเอ็นเอ สิ่งนี้ทำให้มันเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการโคลนตัวอย่างดีเอ็นเอด้วยจำนวนดีเอ็นเอที่ จำกัด ในขณะที่วิธีการนั้นสามารถโคลน DNA ได้ แต่ก็ไม่สามารถนำมาผลิตโปรตีนที่สอดคล้องกันได้

คลายเกลียวดีเอ็นเอ: ดีเอ็นเอในโครโมโซมนั้นขดแน่นในโครงสร้างเกลียวคู่ การให้ความร้อน DNA ถึง 96 องศาเซลเซียสในกระบวนการที่เรียกว่า สูญเสียสภาพธรรมชาติ ทำให้โมเลกุลดีเอ็นเอคลายเกลียวและแยกออกเป็นสองเส้น จำเป็นต้องมีการแยกออกนี้เนื่องจากสามารถโคลนดีเอ็นเอเพียงสายเดียวในครั้งเดียว

การเลือกไพรเมอร์: เช่นเดียวกับการโคลนดีเอ็นเอพลาสมิดเวกเตอร์ลำดับดีเอ็นเอที่จะถูกโคลนจะต้องถูกระบุด้วยการเน้นเป็นพิเศษในจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของส่วนดีเอ็นเอ ไพรเมอร์เป็นเอ็นไซม์ที่ยึดติดกับลำดับรหัสดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงและจะต้องเลือกเพื่อทำเครื่องหมายส่วนดีเอ็นเอเป้าหมาย ไพรเมอร์ที่เหมาะสมจะแนบกับลำดับโมเลกุล DNA เพื่อทำเครื่องหมายจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของกลุ่มเป้าหมาย

การหลอมปฏิกิริยาเพื่อผูกไพรเมอร์: การทำปฏิกิริยาให้เย็นลงถึงประมาณ 55 องศาเซลเซียสเรียกว่า การหลอม. เมื่อปฏิกิริยาเย็นลงไพรเมอร์จะถูกเปิดใช้งานและเชื่อมตัวเองกับเกลียวดีเอ็นเอที่ปลายแต่ละด้านของส่วนดีเอ็นเอเป้าหมาย ไพรเมอร์ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้เท่านั้นและไม่จำเป็นต้องตัดดีเอ็นเอ

การผลิตสำเนาที่เหมือนกันของส่วนดีเอ็นเอเป้าหมาย: ในกระบวนการที่เรียกว่า ส่วนขยายเอนไซม์ TAQ โพลิเมอร์ที่ไวต่อความร้อนจะถูกเพิ่มเข้าไปในปฏิกิริยา ปฏิกิริยาจะถูกทำให้ร้อนถึง 72 องศาเซลเซียสเพื่อกระตุ้นเอนไซม์ เอนไซม์ DNA polymerase ที่ทำงานอยู่จะจับกับไพรเมอร์และคัดลอกลำดับ DNA ระหว่างพวกมัน กระบวนการจัดลำดับและการโคลนดีเอ็นเอเริ่มต้นเสร็จสมบูรณ์

การเพิ่มผลผลิตของดีเอ็นเอโคลน: กระบวนการเริ่มต้นการหลอมและการขยายสร้างสำเนาของกลุ่มดีเอ็นเอที่มีอยู่ค่อนข้างน้อย เพื่อเพิ่มผลผลิตผ่านการจำลองดีเอ็นเอเพิ่มเติมปฏิกิริยาจะถูกทำให้เย็นอีกครั้งเพื่อเปิดใช้งานไพรเมอร์อีกครั้งและปล่อยให้มันจับกับดีเอ็นเออื่น ๆ

จากนั้นให้ความร้อนอีกครั้งปฏิกิริยาจะเปิดใช้งานเอนไซม์โพลีเมอเรสอีกครั้งและจะมีการทำสำเนามากขึ้น รอบนี้สามารถทำซ้ำได้ 25 ถึง 30 ครั้ง

การใช้ Plasmid Vector และ PCR DNA Clone ด้วยกัน

วิธีพลาสมิดเวกเตอร์อาศัยการเริ่มต้นที่เพียงพอของ DNA ในการตัดและแทรกเข้าไปในพลาสมิด DNA ดั้งเดิมน้อยเกินไปส่งผลให้พลาสมิดลดน้อยลงและเริ่มต้นการผลิตดีเอ็นเออย่างช้าๆ

วิธี PCR สามารถสร้าง DNA จำนวนมากได้จาก DNA ดั้งเดิมเพียงไม่กี่เส้น แต่เนื่องจาก DNA ไม่ได้ถูกฝังในเซลล์แบคทีเรียจึงไม่สามารถสร้างโปรตีนได้

เพื่อสร้างโปรตีนที่ถูกเข้ารหัสในชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่จะถูกโคลนจากตัวอย่างดีเอ็นเอเริ่มต้นขนาดเล็กวิธีการทั้งสองสามารถใช้ร่วมกันและพวกเขาสามารถ เติมเต็มซึ่งกันและกัน วิธีแรกใช้วิธี PCR ในการโคลน DNA จากตัวอย่างขนาดเล็กและสร้างสำเนาจำนวนมาก

จากนั้นผลิตภัณฑ์ PCR จะใช้กับวิธีพลาสมิดเวกเตอร์เพื่อปลูกฝัง DNA ที่ผลิตในเซลล์แบคทีเรียที่จะผลิตโปรตีนที่ต้องการ

ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอเพื่อเทคโนโลยีชีวภาพ

ชีววิทยาโมเลกุลใช้การโคลนยีนและการจำลองแบบดีเอ็นเอเพื่อวัตถุประสงค์ทางการแพทย์และการค้า แบคทีเรียที่มีลำดับดีเอ็นเอโคลนใช้ในการผลิตยาและใช้แทนสารที่คนที่มีความผิดปกติทางพันธุกรรมไม่สามารถผลิตเองได้

การใช้งานทั่วไปรวมถึง:

เทคโนโลยีชีวภาพยังใช้การโคลนยีนในการเกษตรเพื่อสร้างลักษณะใหม่ในพืชและสัตว์หรือปรับปรุงลักษณะที่มีอยู่ เมื่อมีการโคลนยีนมากขึ้นจำนวนการใช้ที่เป็นไปได้จะเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ

ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอเพื่อการวิจัย

โมเลกุลดีเอ็นเอประกอบขึ้นเป็นเศษเสี้ยวของวัสดุในเซลล์ที่มีชีวิตและยากที่จะแยกอิทธิพลของยีนต่างๆ วิธีการโคลนดีเอ็นเอส่งมอบลำดับดีเอ็นเอจำนวนมากเพื่อการศึกษาและ DNA กำลังผลิตโปรตีนเช่นเดียวกับที่ทำในเซลล์ดั้งเดิม การโคลนดีเอ็นเอทำให้สามารถศึกษาการดำเนินการนี้เพื่อแยกยีนที่แตกต่างกัน

การวิจัยทั่วไปและการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอรวมถึงการตรวจสอบ:

เมื่อมีการโคลนลำดับดีเอ็นเอมากขึ้นจะง่ายต่อการค้นหาและโคลนลำดับเพิ่มเติม ส่วนดีเอ็นเอโคลนที่มีอยู่สามารถนำมาใช้เพื่อตรวจสอบว่าส่วนใหม่ตรงกับส่วนเก่าและส่วนใดที่แตกต่างกัน การระบุลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายนั้นเร็วขึ้นและแม่นยำยิ่งขึ้น

ตัวอย่างของการโคลนดีเอ็นเอสำหรับยีนบำบัด

ใน ยีนบำบัดยีนโคลนจะถูกนำเสนอต่อเซลล์ของสิ่งมีชีวิตที่มียีนธรรมชาติเสียหาย ยีนที่สำคัญที่สร้างโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการทำงานของสิ่งมีชีวิตที่เฉพาะเจาะจงสามารถกลายพันธุ์เปลี่ยนแปลงโดยการฉายรังสีหรือได้รับผลกระทบจากไวรัส

เมื่อยีนทำงานผิดปกติสารสำคัญจะหายไปจากเซลล์ ยีนบำบัดพยายามที่จะ แทนที่ยีนด้วยเวอร์ชันโคลนที่จะผลิตสารที่ต้องการ.

การรักษาด้วยยีนยังคงเป็นการทดลองและผู้ป่วยบางรายได้รับการรักษาโดยใช้เทคนิค ปัญหาอยู่ที่การระบุยีนเดี่ยวที่รับผิดชอบต่อสภาพทางการแพทย์และส่งสำเนาของยีนจำนวนมากไปยังเซลล์ที่เหมาะสม เมื่อการโคลนนิ่ง DNA เริ่มแพร่หลายมากขึ้นการใช้ยีนบำบัดจึงถูกนำไปใช้ในหลายสถานการณ์

แอปพลิเคชันที่ประสบความสำเร็จล่าสุดได้รวม:

การบำบัดด้วยยีนเป็นหนึ่งในแอพพลิเคชั่นที่มีแนวโน้มมากที่สุดในการโคลนดีเอ็นเอ แต่การใช้งานใหม่ ๆ มีแนวโน้มที่จะเพิ่มจำนวนมากขึ้นเมื่อมีการศึกษาลำดับดีเอ็นเอมากขึ้น การโคลนดีเอ็นเอมอบวัตถุดิบสำหรับวิศวกรรมพันธุกรรมในปริมาณที่ต้องการ

เมื่อทราบถึงบทบาทของยีนและการทำงานที่เหมาะสมสามารถมั่นใจได้โดยการแทนที่ยีนที่มีข้อบกพร่องโรคเรื้อรังจำนวนมากและแม้กระทั่งโรคมะเร็งสามารถถูกโจมตีและรักษาในระดับพันธุกรรมโดยใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอ

เนื้อหาที่เกี่ยวข้อง: