เนื้อหา
- เอนไซม์ จำกัด และไซต์ข้อ จำกัด
- ทิศทางที่ถูกต้อง
- Ligating Sticky Ends ต้องการ DNA น้อยกว่า
- เอ็นไซม์ต่างกันสามารถให้จุดสิ้นสุดของ Sticky เดียวกันได้
การโคลนโมเลกุลเป็นวิธีการทางเทคโนโลยีชีวภาพทั่วไปที่นักเรียนและนักวิจัยทุกคนควรคุ้นเคย การโคลนโมเลกุลโดยใช้เอนไซม์ชนิดหนึ่งที่เรียกว่าเอนไซม์ จำกัด เพื่อตัด DNA ของมนุษย์ออกเป็นชิ้นส่วนที่สามารถแทรกเข้าไปในพลาสมิดดีเอ็นเอของเซลล์แบคทีเรีย เอนไซม์ที่ จำกัด ข้อ จำกัด จะตัด DNA ที่มีเกลียวสองเส้นในช่วงครึ่งปี ขึ้นอยู่กับเอนไซม์ที่ จำกัด การตัดอาจส่งผลให้ทั้งปลายเหนียวหรือปลายทู่ ปลาย Sticky มีประโยชน์มากกว่าในการโคลนโมเลกุลเพราะมั่นใจได้ว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอของมนุษย์นั้นถูกแทรกเข้าไปในพลาสมิดในทิศทางที่ถูกต้อง กระบวนการ ligation หรือการแยกส่วนของ DNA นั้นต้องการ DNA น้อยกว่าเมื่อ DNA มีปลายเหนียว สุดท้ายเอนไซม์หลายข้อ จำกัด ของการ จำกัด จุดสิ้นสุดสามารถสร้างจุดสิ้นสุดแบบเดียวกันได้แม้ว่าแต่ละเอนไซม์จะรู้ลำดับข้อ จำกัด ที่แตกต่างกัน สิ่งนี้จะเพิ่มโอกาสที่ดีเอ็นเอของคุณจะถูกตัดออกโดยเอนไซม์เอ็นไซม์เหนียว
เอนไซม์ จำกัด และไซต์ข้อ จำกัด
เอ็นไซม์ จำกัด เป็นเอ็นไซม์ที่ตัดการรับรู้ลำดับที่เฉพาะเจาะจงบน DNA ที่มีเกลียวคู่และตัด DNA ครึ่งหนึ่งในลำดับนั้น ลำดับที่รู้จักเรียกว่าไซต์ข้อ จำกัด เอ็นไซม์ จำกัด เรียกว่า endonucleases เพราะพวกมันตัด DNA ที่มีเกลียวสองเส้นซึ่งเป็นวิธีปกติของ DNA ที่มีอยู่ในตำแหน่งที่อยู่ระหว่างปลาย DNA มีเอนไซม์ จำกัด มากกว่า 90 ชนิด แต่ละเว็บไซต์รับรู้ข้อ จำกัด ที่แตกต่าง เอนไซม์ที่ถูก จำกัด จะทำการแยกไซต์ที่มีข้อ จำกัด ของมันออกอย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าไซต์อื่นที่พวกเขาไม่รู้จักถึง 5,000 เท่า
ทิศทางที่ถูกต้อง
เอนไซม์ที่ จำกัด นั้นมีอยู่สองคลาสทั่วไป พวกเขาตัด DNA ให้กลายเป็นปลายเหนียวหรือปลายทู่ ปลายเหนียวมีขอบเขตสั้น ๆ ของนิวคลีโอไทด์ซึ่งเป็นหน่วยการสร้างของ DNA ที่ไม่มีการจับคู่ ภูมิภาคที่ไม่มีการจับคู่เรียกว่า overhang สิ่งที่แขวนอยู่ถูกกล่าวว่าเหนียวเพราะมันต้องการและจะจับคู่กับปลายเหนียวอีกอันที่มีลำดับการแขวนอยู่ ปลาย Sticky นั้นเหมือนกับฝาแฝดที่หายไปนานที่พยายามจะกอดซึ่งกันและกันอย่างแน่นหนาเมื่อพบกัน ในทางตรงกันข้ามปลายทู่นั้นไม่เหนียวเหนอะเพราะนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดได้จับคู่กันระหว่าง DNA สองเส้นแล้ว ข้อดีของปลายเหนียวคือชิ้นส่วนดีเอ็นเอของมนุษย์สามารถใส่เข้าไปในพลาสมิดแบคทีเรียในทิศทางเดียวเท่านั้น ในทางตรงกันข้ามถ้าทั้ง DNA ของมนุษย์และพลาสมิดของแบคทีเรียมีปลายทู่ DNA ของมนุษย์สามารถแทรกหัวต่อท้ายหรือต่อท้ายไปยังพลาสมิด
Ligating Sticky Ends ต้องการ DNA น้อยกว่า
แม้ว่า DNA ที่มีปลายแท่งจะมีเวลาค้นหากันได้ง่ายขึ้นเพราะ“ ความหนืด” ปลายเหนียวหรือปลายทู่ไม่สามารถรวมเข้าด้วยกันเป็นส่วนต่อเนื่องของ DNA การก่อตัวของ DNA ต่อเนื่องที่เชื่อมโยงกันอย่างสมบูรณ์นั้นจำเป็นต้องใช้เอนไซม์ที่เรียกว่า ligase Ligases เชื่อมต่อแบ็คโบนของนิวคลีโอไทด์ที่ปลายเหนียวหรือปลายทู่ซึ่งส่งผลให้นิวคลีโอไทด์โซ่ต่อเนื่อง เนื่องจากปลายเหนียวพบกันเร็วขึ้นเนื่องจากแรงดึงดูดซึ่งกันและกันกระบวนการของ ligation จึงต้องใช้ DNA ของมนุษย์น้อยลงและ DNA ของพลาสมิดลดลง ปลายทู่ของดีเอ็นเอและพลาสมิดมีโอกาสน้อยที่จะพบกันและดังนั้นการผูกปลายปลายทู่นั้นจะต้องให้ DNA ใส่เข้าไปในหลอดทดลองมากขึ้น
เอ็นไซม์ต่างกันสามารถให้จุดสิ้นสุดของ Sticky เดียวกันได้
ไซต์ข้อ จำกัด ตั้งอยู่ทั่วจีโนมของสิ่งมีชีวิต แต่ไม่ได้เว้นระยะเท่ากัน ในพลาสมิดพวกมันสามารถถูกออกแบบให้ตั้งอยู่ติดกัน นักวิทยาศาสตร์ที่ต้องการตัด DNA ของมนุษย์ออกจากจีโนมมนุษย์ต้องค้นหาไซต์ที่มีข้อ จำกัด ทั้งด้านหน้าและด้านหลังของส่วนของดีเอ็นเอ นอกจากนี้เพื่อให้แน่ใจว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกแทรกในทิศทางที่ถูกต้องเอนไซม์ปลายเหนียวที่แตกต่างกันสามารถสร้างปลายเหนียวเดียวกันแม้ว่าพวกเขาจะรู้จักลำดับข้อ จำกัด ที่แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น BamHI, BglII และ Sau3A มีลำดับการรู้จำที่แตกต่างกัน แต่สร้างจุดยึด GATC ที่เหมือนกัน สิ่งนี้จะเพิ่มความเป็นไปได้ที่จะมีไซต์ข้อ จำกัด ปลายเหนียวที่ขนาบยีนที่คุณสนใจ