เนื้อหา
- TL; DR (ยาวเกินไปไม่ได้อ่าน)
- บัฟเฟอร์และเกลือ
- ผงซักฟอกละลาย
- Chelating ตัวแทนและสารยับยั้ง
- อัลคาไลน์ Lysis
Lyse เป็นคำที่มาจากภาษากรีกและหมายถึงเพียง "แยก" หรือ "แตกออก" Aptly คำศัพท์ที่เกี่ยวข้องกับสิ่งที่เกิดขึ้นกับเซลล์ใน lysis buffer ซึ่งเป็นวิธีแก้ปัญหาที่เปิดให้แยกเนื้อหาออกมา นักวิทยาศาสตร์ใช้บัฟเฟอร์ lysis เมื่อทำการแยก DNA หรือโปรตีนออกจากเซลล์เพื่อทำการวิเคราะห์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของแบคทีเรีย ประเภทของเซลล์ lysis buffer แตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของการทดสอบถึงแม้ว่าต่อไปนี้เป็นตัวเลือกทั่วไปบางอย่าง
TL; DR (ยาวเกินไปไม่ได้อ่าน)
บัฟเฟอร์ Lysis ช่วยแยกเซลล์เปิดเพื่อให้สามารถเข้าถึงหรือลบเนื้อหาได้ ตัวอย่างบางส่วน ได้แก่ เกลือผงซักฟอกสารคีเลตและสารยับยั้งและสารเคมีอัลคาไลน์
บัฟเฟอร์และเกลือ
บัฟเฟอร์คงความเป็นกรดด่างในขณะที่เซลล์แตกตัว Tris-HCL ย่อมาจากหนึ่งในสารเคมีที่พบบ่อยที่สุดสำหรับการบัฟเฟอร์ที่ pH 8 HEPES เป็นสารเคมีบัฟเฟอร์ทั่วไปอีกอย่างหนึ่งในการทดลองเหล่านี้ เกลือโซเดียมคลอไรด์อาจเพิ่มความแข็งแรงของไอออนิกความเข้มข้นโดยรวมของตัวถูกละลายภายนอกเซลล์ จุดสุดท้ายนี้มีความสำคัญเนื่องจากน้ำสามารถกระจายผ่านเยื่อหุ้มเซลล์จากบริเวณที่มีความเข้มข้นของตัวถูกละลายต่ำไปยังบริเวณที่มีความเข้มข้นของตัวถูกละลายสูง
ผงซักฟอกละลาย
ผงซักฟอกละลายเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อให้เนื้อหาของเซลล์สามารถหลบหนีได้ โครงสร้างโมเลกุลแบบ have และ amphipathic (เช่นโมเลกุลที่ปลายด้านหนึ่งที่มีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุลของน้ำได้อย่างง่ายดายในขณะที่ปลายอื่น ๆ ที่ไม่ชอบน้ำหรือ "น้ำที่น่ากลัว" ไม่ได้) พวกเขาสามารถละลายไขมันโดยสร้างไมเซลล์กลุ่มเล็ก ๆ ที่หางของโมเลกุลของผงซักฟอกที่ไม่เข้ากับน้ำชี้ไปที่โมเลกุลไขมัน ผงซักฟอกทั่วไป ได้แก่ โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตหรือ SDS, NP-40 และ tritonX
Chelating ตัวแทนและสารยับยั้ง
โดยทั่วไปแล้วบัฟเฟอร์ของ Lysis จะรวมถึงสารคีเลติ้งเช่นกรดเอทิลดีอามีนเอทเทราไซติก (EDTA) หรือกรดเอทิลีนไกลคอล tetraacetic (EGTA) สารเคมีเหล่านี้ผูกกับไอออนของโลหะที่มีประจุบวกสองค่า (เช่นแมกนีเซียมและแคลเซียม) ทำให้ไม่สามารถใช้งานได้สำหรับปฏิกิริยาอื่น ๆ DNAs หลายตัว (โปรตีนที่เคี้ยวขึ้น DNA) และโปรตีเอส (โปรตีนที่เชือดโปรตีนอื่น ๆ ) จำเป็นต้องมีแมกนีเซียมไอออนในการทำงานดังนั้นโดยการตัดพวกเขาออกจากส่วนประกอบสำคัญนี้ EDTA และ EGTA ช่วยลดระดับโปรตีเอสหรือกิจกรรม DNAse พวกมันไม่ได้ออกกฎอย่างสมบูรณ์อย่างไรก็ตามและโปรตีเอสบางตัวไม่ได้ขึ้นอยู่กับปัจจัยร่วมของแมกนีเซียมดังนั้นบัฟเฟอร์ lysis บางครั้งก็รวมถึงสารเคมีที่เรียกว่า protease inhibitors ซึ่งจะจับกับโปรติเอสและป้องกันไม่ให้ทำงานอย่างถูกต้อง
อัลคาไลน์ Lysis
อัลคาไลน์ lysis เป็นเทคนิคที่ใช้กันทั่วไปในการทำให้บริสุทธิ์พลาสมิดจากแบคทีเรีย อันแรกประกอบด้วยกลูโคส, tris-HCL buffer, EDTA และ RNA กลูโคสจะสร้างความเข้มข้นของตัวถูกละลายสูงภายนอกของแบคทีเรียดังนั้นพวกมันจึงกลายเป็นป้อแป้เล็กน้อยซึ่งทำให้พวกมันง่ายขึ้น ฟังก์ชั่น EDTA และ tris-HCL ดังที่อธิบายไว้แล้วในขณะที่ RNAse จะเคี้ยว RNA ใด ๆ ภายในเซลล์เพื่อให้หลุดออกไป วิธีการแก้ปัญหาที่สอง lyses เซลล์จริง อันนี้ประกอบด้วยผงซักฟอก SDS และ NaOH ซึ่งเพิ่มค่า pH เป็น 12 หรือสูงกว่าทำให้โปรตีนในเซลล์เสื่อมสภาพและทำให้ DNA แยกออกเป็นเส้นเดี่ยว วิธีที่สามประกอบด้วยโพแทสเซียมอะซิเตทเพื่อคืนค่า pH ให้อยู่ในระดับที่เป็นกลางมากขึ้นเพื่อให้ดีเอ็นเอของพลาสมิดสามารถกลับมารวมกันได้ ในขณะเดียวกันโปรตีนเอทิลแอลกอฮอล์ที่เป็นก้อนจะจับตัวเป็นก้อนในขณะที่ไอโอไดซ์ซิล - ซัลเฟตจะรวมตัวกันกับโพแทสเซียมไอออนเพื่อสร้างสารประกอบที่ไม่ละลายน้ำซึ่งจะตกตะกอนจากสารละลาย