เนื้อหา
ในปฏิกิริยาทางเคมีเร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์เอนไซม์จะลดปริมาณพลังงานกระตุ้นที่จำเป็นโดยการเกาะติดกับพื้นผิวชั่วคราวและบิดเป็นสถานะที่ทำให้เครียด k (ตัวเร่งปฏิกิริยา) หรือ "kcat" สำหรับปฏิกิริยาหมายถึงค่าคงที่ความเข้มข้นอิสระสำหรับอัตราที่เอนไซม์เฉพาะสามารถเผาผลาญสารตั้งต้นเป็นโมเลกุลของผลิตภัณฑ์ ในการคำนวณ kcat นั้นนักวิทยาศาสตร์ได้ทำการผสมหลอดทดลองหลายอันกับความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่แตกต่างกัน (รู้จักกันในชื่อ "การทดสอบด้วยเอนไซม์") และทดสอบในช่วงเวลาคงที่ด้วยเครื่องวัดแสงแบบแสงเพื่อวัดความเข้มข้นของโมเลกุลผลิตภัณฑ์ ข้อมูลนี้จะถูกพล็อตกราฟและวิเคราะห์
การคำนวณความเร็วเริ่มต้น
พล็อตกราฟของความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์เทียบกับเวลาสำหรับข้อมูลจากการทดสอบด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลองแรก หมายเหตุ: แกนนอนควรเป็น "เวลา" และแกนแนวตั้งควรเป็น "ความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์"
คำนวณเส้นถดถอยเชิงเส้นสำหรับจุดข้อมูลที่คุณพล็อตในส่วนที่ 1 ขั้นตอนที่ 1 ในขณะที่ Excel และเครื่องคิดเลขกราฟสามารถกำหนดรูปแบบเชิงเส้นนี้ได้อย่างง่ายดายคุณสามารถได้มาจากการประมาณความชันของเส้นถดถอยโดยการหารความแตกต่าง คะแนนจากความแตกต่างในเวลา
บันทึกความชันของเส้นถดถอยเชิงเส้นจากส่วนที่ 1 ขั้นตอนที่ 2 เป็น "ความเร็วปฏิกิริยาเริ่มต้น (Vo)" หมายเหตุ: ในโมเดลบรรทัดการถดถอย "= m + b" สัมประสิทธิ์ "m" คือความชัน
ทำซ้ำขั้นตอนที่ 1, 2 และ 3 สำหรับหลอดทดสอบที่เหลือในชุดทดสอบ
กำลังคำนวณ Vmax
พล็อตผกผันของความเข้มข้นของสารตั้งต้นสำหรับแต่ละหลอดทดลองเปรียบเทียบกับค่าผกผันของความเร็วปฏิกิริยาเริ่มต้น (จากส่วนที่ 1, ขั้นตอนที่ 4) ตัวอย่างเช่นหากความเร็วเริ่มต้นสำหรับหลอดทดลองที่มีความเข้มข้นของสารตั้งต้นเริ่มต้นที่ 50 micromolar (uM) คือ 80 uM / s ผู้ที่จะเป็น 1/50 uM สำหรับความเข้มข้นของสารตั้งต้นและ 1/80 uM / s สำหรับการเริ่มต้น ความเร็ว. หมายเหตุ: ความเข้มข้นของวัสดุพิมพ์ผกผันควรอยู่บนแกนนอนและความเร็วเริ่มต้นผกผันควรอยู่บนแกนตั้ง
หมายเหตุ: ความเข้มข้นของสารตั้งต้นควรอยู่บนแกนนอนและความเร็วปฏิกิริยาเริ่มต้นควรอยู่บนแกนตั้ง
กำหนดเส้นการถดถอยเชิงเส้นสำหรับแผนภูมิที่คุณวางแผนไว้ในส่วนที่ 2 ขั้นตอนที่ 1 หมายเหตุ: เนื่องจากคุณจำเป็นต้องรู้จุดตัดแกน y สำหรับเส้นการถดถอยคุณควรป้อนจุดจากส่วนที่ 2 ขั้นตอนที่ 1 ลงใน Excel หรือ เครื่องคิดเลขกราฟและใช้ฟังก์ชั่นการสร้างแบบจำลองการถดถอย
หาร 1 ด้วย y-intersect จากเส้นการถดถอยเชิงเส้น สิ่งนี้จะให้คุณค่าของการผกผันของ Vmax ซึ่งเป็นความเร็วปฏิกิริยาสูงสุดสำหรับเอนไซม์ หมายเหตุ: หากโมเดลการถดถอยเชิงเส้นใช้รูปแบบ "= m + b" ดังนั้นค่าของ "b" จะเป็น y-intersect หาร 1 ด้วย "b" เพื่อคำนวณค่าผกผันของ Vmax
หาร 1 ด้วยผลลัพธ์จากส่วนที่ 2 ขั้นตอนที่ 3 เพื่อคำนวณมูลค่าที่แท้จริงของ Vmax
กำหนดความเข้มข้นของเอนไซม์ในชุดทดสอบ (ดูข้อมูลดิบ) หมายเหตุ: ความเข้มข้นของเอนไซม์จะเหมือนกันสำหรับหลอดทดลองทั้งหมด เฉพาะความเข้มข้นของสารตั้งต้นเท่านั้นในการทดสอบ
แบ่ง Vmax (จากส่วนที่ 2, ขั้นตอนที่ 4) โดยความเข้มข้นของเอนไซม์ (จากส่วนที่ 2, ขั้นตอนที่ 5) ผลลัพธ์คือค่าของ Kcat